Teknolojinin Konusu

Buluş, gen tedavisi uygulamalarında son yıllarda en çok tercih edilen gen nakil araçlarından olan HIV tabanlı lentiviral vektörlerin, ölçeklenebilir özellikte, silindirik hücre kültürü şişelerinde üretimi için geliştirilmiş bir yöntem ile ilgilidir. Geliştirilen yöntemde, silindirik hücre kültürü şişelerinin dönme hızları dahil olmak üzere kullanılan transfeksiyon ajanı, besiyerleri, ve transfeksiyonda kullanılan plazmidlerin oranları optimize edilmiştir. Beraberinde yapılan önfiltrasyon ve sukroz tampon etkisi ile gerçekleştirilen ultrasantrifügasyon işlemleriyle, yüksek konsantrasyonda ve yüksek kalitede lentiviral vektörler üretilmiştir

 

Teknolojinin Avantajları

• 12 adet 15 cm’lik petride üretilen hücre miktarına yapılan transfeksiyon sonucunda elde edilen lentiviral vektör miktarına eşdeğer miktarda vektörün tek bir uygulamayla silindirik hücre kültürü şişelerinde üretimi sağlanmıştır. Bu teknikte üretim sırasında kullanılan transfeksiyon ajanı ile birlikte, 12 kere uygulanması gereken işlemin tek bir seferde yapılıyor olması, standardizasyon ve verimlilik sağlamaktadır.
• Geliştirilen tekniği diğerlerinden ayıran özelliğin en başında sanayiye uygulanılabilirlik açısından ölçeklenebilir parametrelere sahip olması ve büyük ölçekli üretim öncesi ara ölçekli üretim için örnek teşkil etmesidir.
• Üretim sonrası klinik uygulanabilirlik için yapılması gereken saflaştırma basamaklarında daha az sıvı hacmi ile çalışılmasına olanak sağlayan bir yöntem olması açısından ekonomik ve uygulamada kolaylık sağlayan bir teknik olma özelliği taşımaktadır.
• Hücre kültürü petrilerinde yapılan çok tekrarlı işlemlere kıyasla tek seferde gerçekleştiriliyor olması, üretimin kolay uygulanabilirliği ile birlikte, çok tekrarlı işlemlerde oluşabilecek hata payını azaltması, ve gerçekleşebilecek kontaminasyon ve heterojenite risklerini azaltması yönünden de büyük bir avantaj sağlamaktadır.

 

 

Şekil 1. Silindirik hücre kültürü şişelerinde Lentiviral Gen Tedavi Vektör Üretim Yönteminin akış diyagramı;
1)Hücre kültürü petrilerini kaplamış olan 293T/17 hücrelerinin silindirik hücre kültürü şişelerine ekim aşamasını ve hücrelerin yüzeye tutunabilmesi şişelerin 24 saat süreyle 0,3 rpm hızda dönme aşamasını

2) Yüzeye tutunan hücrelerin verimli lentiviral vektör üretimi için gereken hücre sayısına ulaşması için besiyeriyle daha fazla temasını sağlamak amacıyla şişelerin 16 saat süreyle 1 rpm hızda dönme aşamasını
3) Lentiviral vektör yapısını oluşturacak olan 4 farklı plazmidin HBS ve CaCl2 kullanılarak biraraya getirilmesi aşamasını
4) Hazırlanan plazmid karışımının silindirik hücre kültürü şişelerine aktarım aşamasını ve lentiviral vektör partiküllerinin oluşması için 72 saat süreyle 1 rpm hızda d.ndürülme aşamasını
5) Viral vektör partikülleri içeren hücre süpernatantının ultrasantrifüj tüplerine aktarılarak süpernatantların altında sükroz tabakasının oluşturulma aşamasını
6) Hazırlanan tüplerin ultrasantrifüj cihazına yerleştirilerek saflaştırılma aşamasını
7) Ultrasantrifüj sonrası tüplerin dibine çöken lentiviral pertiküllerin süpernatant kısmından uzaklaştırılarak elde edilmesi aşamasını ifade etmektedir.

 

Patent Sahibi: Prof. Dr. Salih ŞANLIOĞLU
Patent No: 2016/03933